Disrupsi Sampel Laboratorium Berbasis Bead Mill untuk Mendukung Ekstraksi Molekuler

Salah satu preparasi awal terhadap sampel adalah proses destruksi, giling, lisis, serta homogenisasi sampel. Proses destruksi dan giling sampel disebut juga disrupsi dalam aplikasi sampel biologi. Disrupsi membantu memecah sampel atau jaringan biologi menjadi berukuran kecil sehingga memungkinkan untuk diproses lanjut terutama pada protokol ekstraksi standar yang umumnya mensyaratkan bentuk sampel halus seperti bubuk. Disrupsi secara fisik atau mekanis dapat berfungsi sekaligus untuk menghomogenisasi sampel, baik distribusi matriks maupun ukurannya. Selain itu, disrupsi juga merupakan proses lisis secara fisik untuk memecah sel sehingga mengeluarkan molekul yang terkandung di dalamnya untuk diekstraksi. Sejumlah alasan tersebut berperanan dalam meningkatkan efisiensi, reprodusibilitas, dan kuantitas ekstraksi molekuler.

Disrupsi sampel dapat dilakukan manual menggunakan alat yang dioperasikan secara mekanik dengan tangan. Salah satu preparasi manual yang umum dikenal adalah penggerusan dengan bantuan lumpang dan alu serta bisa dibantu nitrogen cair. Disrupsi juga dapat dilakukan secara fisik dengan bantuan mesin, seperti blender, grinder, sonicator, dan bead mill. Selain itu, disrupsi juga bisa dilakukan secara kimia menggunakan bahan bersifat dekstruktif berupa asam, deterjen, enzim, dan buffer lisis lainnya. Disrupsi secara kimia perlu penanganan pasca perlakuan terhadap kandungan residu kimia yang bisa berefek sebagai gangguan pada analisis berikutnya. Berbeda dengan disrupsi kimia, disrupsi secara fisik tidak perlu penanganan ekstra setelah perlakuan sehingga dapat langsung dilanjutkan ke perlakuan berikutnya. Pemilihan teknik dan metode disrupsi fisik perlu disesuaikan dengan kondisi dan situasi. Jika kondisi sampel mudah dipreparasi dan jumlahnya sedikit, maka cara manual menjadi pilihan utama jika mempertimbangkan efisiensinya. Sebaliknya, jika sampel sulit diolah dan jumlahnya banyak maka prosesnya menjadi tidak efisien. Oleh karena itu, diperlukan alat bantu disrupsi yang tepat. Salah satu alat disrupsi powerfull adalah bead mill.

Bead mill menggunakan bead, bola keras berukuran kecil, berbahan logam, kaca, keramik dan lain sebagainya, sebagai media tumbukan ke sampel. Pada proses bead milling, energi mekanik berupa goyangan, kocokan, atau getaran diberikan ke wadah yang berisi sampel dan bead. Goyangan tersebut merupakan agitasi berupa ayunan berulang (periodik) seperti vibrasi skala besar. Goyangan pada wadah ditransfer ke bead sehingga membentuk tumbukan. Tumbukan yang terjadi terdiri atas beberapa mode/jenis, yatu “crushing” yang dihasilkan dari orientasi bead dengan arah tumbukan yang tepat berhadapan, “shearing” seperti guntingan dari bead yang berhadapan sebagian, serta “hitting” dari himpitan banyak bead. Energi dari tumbukan bertubi-tubi dari bola-bead mengenai sampel, seperti proyektil gotri/bead yang membombardir sampel sehingga sampel terdisrupsi. Selain disrupsi, bead mill juga berperan sebagai metode lisis sampel biologi secara fisik sehingga digunakan untuk ekstraksi molekuler. Dalam praktiknya, proses bead mill bukan hanya menghancurkan sampel namun juga membentuk ukuran partikel yang lebih kecil dan terdistribusi dengan baik sehingga membentuk sampel yang homogeny. Oleh karena itu, alat ini berperan juga sebagai homogenizer. Bead mill tersedia untuk berbagai aplikasi. Untuk laboratorium, diperlukan bead mill dengan spesifikasi khusus.

Salah satu bead mill khusus untuk ekstraksi molekuler di laboratorium adalah Bead Ruptor yang merupakan tipe disruptor OMNI. Disruptor OMNI berfokus pada homogenizer dengan berbagai jenis prinsip kerja. Ada tiga jenis disrupter OMNI yang berbasis instrumentasi atau mesin, yaitu tipe bead mill, sonicator, dan rotor stator grinder. Tipe bead mill OMNI yang mempunyai performa tinggi adalah Bead Ruptor 24 Elite dan Bead Ruptor 96. Bead Ruptor (BR) didesain khusus untuk mendukung kebutuhan disrupsi, lisis, dan homogenisasi sampel untuk mendapatkan target molekul DNA, RNA, dan protein. BR dapat mendisrupsi sampel secara mudah, cepat, dan meningkatkan hasil ekstraksi molekuler. Spesifikasi tube dan ukuran bead pada BR dibuat untuk kebutuhan molekuler tersebut, termasuk pemenuhan syarat bebas nuklease dan residu asam nukleat. Bead Ruptor memiliki cakupan aplikasi sampel yang luas, baik pada sampel mikroorganisme, hewan, dan tanaman, baik untuk sampel lunak hingga keras seperti rambut, biji, akar, tulang ,dan lain sebagainya.

Aplikasi BR telah didokumentasikan dalam application note dan laporan demo. Kita akan jabarkan beberapa aplikasi, dimulai dari kenampakkan fisik hasil disrupsi Bead Ruptor, lalu pengaruh disrupsi terhadap ekstraksi molekul sensitif dengan metode tumbukan bead dan perbandingannya dengan disrupsi manual, serta evaluasi hasil disrupsi untuk keperluan aplikasi hilir (downstream) dengan membandingkan tumbukan bead pada metode kering dan cair. Hasil disrupsi secara fisik dibahas dalam application note #202007: “Dry Grinding Hair using the Bead Ruptor Elite” mengenai tantangan preparasi sampel rambut yang dibahas dari sisi keberhasilan disrupsi berdasarkan kenampakkan fisik. Perbandingan disrupsi manual dan Bead Ruptor dan evaluasi hasil ekstraksinya dijabarkan dalam Application note #201801: “High Throughput RNA Extraction from Mus musculus Tissues using The Omni Tissue RNA Kit and The Bead Ruptor 12”. Terkait evaluasi untuk aplikasi hilir, Bead Ruptor menggunakan AGM untuk disrupsi secara kering dan cair pada sampel biji dikaji dalam application note #202202: “Simplifying Chickpea Seed Sample Preparation Using the Bead Ruptor™ 96”. Aplikasi tersebut akan dikaji lebih lanjut berikut ini.

Rambut adalah sampel yang bersifat non invasif, sederhana, dan cepat dalam pengambilannya. Molekul target seperti obat, hormon, protein, dan DNA dapat diekstrasi dari rambut. Tantangan utama ekstraksi molekuler dari rambut adalah efisiensinya yang rendah. Namun Diperlukan alat yang tepat untuk mendisrupsi sampel rambut. Gunting bisa memotong rambut, namun tidak bisa memecah rambut menjadi bubuk/partikel kecil dan homogen. Demikian juga dengan blender (khusus laboratorium), gerakan cepat mata pisau memang memberikan dampak pemotongan namun volume ruang yang besar menjadikan sampel sulit bahkan tidak mungkin terdisrupsi sempurna dan tidak sesuai untuk sampel yang berjumlah sedikit. Demikian pula proses manual menggunakan gunting dan lumping alu disertai nitrogen cair, hasilnya tidak cukup optimal memecah sampel rambut menjadi halus sehingga tidak efisien untuk ekstraksi molekulernya.

Salah satu solusi untuk mengatasi kendala disrupsi pada sampel rambut adalah menggunakan Bead Ruptor untuk mendisrupsi sampel rambut menjadi bubuk dan homogen. Bayangkan anda bisa mendapatkan sampel rambut yang didisrupsi hanya dalam hitungan menit sebagaimana yang dipublikasikan dalam application note #202007. Tiap sampel dapat diproses sekitar 2 menit dan sebanyak 24 sampel menggunakan Bead Ruptor Elite dengan tube 2 mL. Bead Ruptor Elite telah digunakan di lab di berbagai penjuru dunia untuk meningkatkan reprodusibilitas dan efisiensi ekstraksi molekuler serta merupakan alat preparasi semi otomatis untuk sampel rambut. Prosedur menggunakan bead milling menjadi tahap preparasi awal untuk mengoptimalkan disrupsi sampel rambut sebelum lanjut ke analisis hilir seperti PCR, GC-MS, LC-MS/MS, DNA sequencing, dan lainnya.

Pada Application note #201801, menunjukkan ekstraksi RNA yang didisrupsi menggunakan Bead Ruptor lebih baik dibandingkan cara manual. Hasil ekstraksi RNA diharapkan tidak banyak terdegradasi atau disebut mempunyai nilai integritas yang tinggi. Nilai integritas RNA (Integrity Number) pada laporan ini berdasarkan algoritma instrumen Bioanalyzer yang digunakan. Rentang nilai integritas tersebut adalah 1 – 10, semakin tinggi nilai integritas maka RNA yang diperoleh semakin baik karena tidak terdegradasi atau lebih utuh, artinya nilai 10 menyatakan paling utuh, sebaliknya nilai 1 menyatakan paling buruk terdegradasi. Secara keseluruhan, Bead Ruptor cenderung menghasilkan integritas yang tinggi (7,2 – 8,9) bahkan dapat melebihi metode manual (7,2 – 7,7). Oleh karena itu, dapat disimpulkan secara garis besar bahwa disrupsi dengan Bead Ruptor lebih baik dibandingkan metode manual berdasarkan kualitas hasil ekstraksi walaupun preparasi dengan Bead Ruptor tidak menggunakan nitrogen cair. Terkait kuantitas, sebagian besar konsentrasi hasil ekstraksi sampel yang didisrupsi dengan Bead Ruptor juga lebih tinggi dibandingkan metode manual. Tiga jaringan, yaitu hati, jantung, paru-paru, yang didisrupsi menggunakan Bead Ruptor mempunyai konsentrasi yang lebih besar hingga 2 - 4 kali lipat metode manual, sedangkan ginjal (186 ng/μL) mendekati manual (192,3 ng/μL).

Bead Ruptor juga digunakan dalam protokol ekstraksi molekuler sampel biji tanpa menggunakan nitrogen cair seperti pada application note #202202. Untuk mendukung efektifitas Bead Ruptor terhadap sampel tanaman, maka dapat digunakan asesoris pendukung yang disebut active grinding media (AGM). Tantangan utama pada sampel tanaman adalah mendisrupsi jaringan seluloid. Oleh karena itu, diperlukan solusi seperti AGM yang merupakan terobosan Omni. AGM berbentuk seperti pegas heliks yang dapat terkompresi dan memanjang kembali. Desain AGM memungkinkan terjadinya shearing (guntingan) sebagai mekanisme utama. Ketika terkompresi, maka pegas dapat menjepit dan kemudian menyebabkan guntingan sehingga sampel terdisrupsi. Mekanisme ini efektif untuk memecah jaringan pada tanaman yang sulit didisrupsi dengan tumbukan biasa.

Evaluasi dilakukan terhadap efektifitas hasil ekstraksi sampel biji yang didapatkan dari application note Bead Ruptor tersebut (#202202). Evaluasi juga membandingkan 2 metode disrupsi, yaitu secara kering (dry grinding/disrupsi kering) dan secara cair (liquid grinding/disrupsi cair) yaitu sampel ditambahkan pelarut berupa buffer lisis. Evaluasi awal dilakukan dengan nanospektrofotometri untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian berdasarkan rasio absorbansi A260/A280. Hasil ekstraksi DNA dapat diinterpretasikan murni jika rasio absorbansi berada pada rentang 1,8 – 2,0, di bawah itu berarti ada ketidakmurnian terutama karena adanya kandungan protein & fenol. Pada tabel tersebut, didapatkan kemurnian yang tinggi pada kedua metode berdasarkan rasio A260/A280, yaitu menyentuh angka 2,0. Walaupun kemurnian keduanya sama, namun ada perbedaan jumlah konsentrasi DNA yang diperoleh pada hasil ekstraksinya. Konsentrasi DNA pada ekstrak disrupsi cair lebih besar hingga 4 kali lipat lebih dibandingkan disrupsi kering. Identifikasi lanjut terhadap hasil ekstraksi dilakukan secara spesifik menggunakan qPCR dengan target gen 18S rRNA. Kurva sinyal yang teramplifikasi menunjukkan terdeteksi positif terdapat keberadaan sekuen konservatif dari eukariot. Hal ini menunjukkan semua sampel berhasil diesktraksi DNA-nya dan sesuai target yang diinginkan.

Secara garis besar, dapat disimpulkan bahwa sampel di laboratorium perlu didisrupsi supaya homogen, reprodusibel, dan efisien dalam mendukung ekstraksi molekuler. Berdasarkan uji yang terdokumentasi dalam application note, dilaporkan bahwa sampel-sampel berupa rambut, jaringan organ, serta biji dapat didisrupsi dengan baik menggunakan Bead Ruptor dan diperoleh hasil ekstraksi yang baik. Hasil ekstraksi sampel yang didirupsi dengan Bead Ruptor lebih baik dibandingkan cara manual menggunakan lumpang, alu, dan nitrogen cair sehingga diperoleh RNA yang baik secara kuantitas dan kualitas. RNA yang terekstraksi mempunyai integritas tinggi bahkan lebih baik dibandingkan sampel yang didisrupsi secara manual. Demikian juga dengan target DNA, diperoleh kualitas dan kuantitas yang baik berdasarkan nanospektrofotometri. Identifikasi dilakukan secara spesifik menggunakan qPCR. Semua hasil ekstraksi sampel terdeteksi positif sehingga menunjukkan sampel berhasil diesktraksi DNA-nya dan sesuai target yang diinginkan.

Untuk informasi lanjut terkait Bead Ruptor, bisa diakses pada link berikut:

Brosur Bead Ruptor 24

Brosur Bead Ruptor 96

Penulis : Sujono M.Si
Editor : Agung Nurfaizal

Mari Terhubung dengan Kami

Phone : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0858 8880 0005

Kunjungi media sosial Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/

Back

Our News

Disrupsi Sampel Laboratorium Berbasis Bead Mill untuk Mendukung Ekstraksi Molekuler