EvaGreen® Dye: Pewarna Ramah Lingkungan yang dapat Meningkatkan Sensitivitas Reaksi pada Aplikasi qPCR
EvaGreen® Dye: Pewarna Ramah Lingkungan yang dapat Meningkatkan Sensitivitas Reaksi pada Aplikasi qPCR
EvaGreen® Dye adalah pewarna berfluoresensi yang bekerja dengan menyisip pada untai ganda DNA. EvaGreen® Dye ideal untuk PCR kuantitatif (qPCR) dan banyak aplikasi lainnya. EvaGreen® Dye merupakan buah karya Ilmuwan dari Biotium, yang merancang pewarna dengan mempertimbangkan beberapa sifat penting dari pewarna yang relevan dengan PCR, antara lain penghambatan PCR, keamanan, stabilitas, dan spektrum fluoresensi pewarna sehingga menghasilkan pewarna yang lebih unggul dari SYBR® Green I dan pewarna PCR komersial lainnya. EvaGreen® Dye digunakan pada campuran mastermix qPCR, yang menggabungkan kecerahan dan sensitivitas superior, serta kemampuan untuk melakukan analisis kurva leleh (Melt curve) dengan sensitivitas tinggi dalam reaksi yang sama. Selain itu, EvaGreen® Dye tidak beracun, tidak mutagenik, dan tidak berbahaya bagi lingkungan.
Baca Juga : Droplet Digital PCR ddPCR Meningkatkan Akurasi Kuantifikasi DNA
Meskipun tidak ada data keamanan yang tersedia untuk pewarna PCR dan HRM lainnya (misalnya, . SYBR® Green I, SYTO9, LC Green, BRYT Green, dan ResoLight), semua pewarna tersebut diketahui dapat memasuki sel dalam hitungan menit, sehingga berpotensi menimbulkan resiko genotoksisitas. Pewarna SYBR® Green I ternyata lebih beracun bagi lingkungan daripada etidium bromida, salah satu mutagen paling terkenal. SYBR® Green I telah diketahui dapat mengganggu mekanisme perbaikan DNA dalam sel.
Dengan pemikiran tersebut, para ilmuwan Biotium merancang EvaGreen® Dye dengan sifat impermeabel terhadap membran sel dengan meningkatkan ukuran molekul dan muatan pewarna. Karena EvaGreen® Dye tidak dapat berinteraksi dengan DNA genom dalam sel hidup, EvaGreen® jauh lebih aman daripada pewarna lainnya. Tes laboratorium independen telah mengkonfirmasi bahwa EvaGreen® adalah non-mutagenik, non-sitotoksik dan aman untuk kehidupan akuatik. EvaGreen® Dye telah memenuhi standar peraturan limbah berbahaya lingkungan di negara bagian California (CCR 22).
Baca Juga: EvaGreen® Dye: Pewarna Ramah Lingkungan yang dapat Meningkatkan Sensitivitas Reaksi pada Aplikasi qPCR
EvaGreen® Dye lebih aman daripada SYBR® Green I karena tidak dapat menembus membran sel dan tidak berinteraksi dengan DNA di dalam inti sel hidup.
Mekanisme Kerja EvaGreen® Dye
Pewarna EvaGreen® dirancang menggunakan konsep pengikatan DNA untai ganda melalui mekanisme “release on demand”. Pewarna EvaGreen® terdiri dari dua monomer yang dihubungkan oleh spacer fleksibel. Ketika tidak ada DNA untai ganda, pewarna EvaGreen® dimer memiliki konformasi loop yang tidak aktif. Ketika DNA untai ganda tersedia, konformasi loop berubah menjadi konformasi acak yang mampu berikatan dengan DNA untai ganda untuk memancarkan fluoresensi. Kesetimbangan kimia tersebut menyebabkan EvaGreen® dapat diformulasikan pada mastermix PCR dengan konsentrasi pewarna relatif tinggi untuk memaksimalkan sinyal fluoresensi tanpa penghambatan PCR, sehingga cocok untuk aplikasi qPCR dan HRM.
EvaGreen® berikatan dengan DNA untai ganda menggunakan konsep “release on demand”
Keunggulan EvaGreen® Dye
Aman bagi lingkungan karena bersifat non-mutagenik, non-sitotoksik, dan aman untuk kehidupan akuatik sehingga penanganan yang aman dan pembuangan yang mudah ke saluran pembuangan.
Jauh lebih terang daripada SYBR® Green I untuk mendeteksi amplifikasi.
Penghambatan PCR rendah sehingga memungkinkan penggunaan konsentrasi pewarna jenuh atau tinggi untuk sinyal maksimal dan analisis kurva leleh DNA beresolusi tinggi.
Sangat stabil selama penyimpanan atau dalam kondisi PCR.
Berfungsi sebagai pewarna qPCR dan pewarnaan gel DNA
Dapat digunakan untuk PCR multipleks dan ddPCR
Baca Juga : Mengenal Preparasi Sel Punca “Stem Cell” Untuk Riset dan Terapi
Performa qPCR dengan EvaGreen® Dye vs SYBR® Green
Pewarna PCR memancarkan fluoresensi dengan membentuk kompleks pewarna-DNA. Interaksi pewarna dengan DNA pasti akan mempengaruhi reaksi PCR. Penghambatan PCR oleh zat warna dapat terjadi pada tahap awal PCR, dimana rasio zat warna terhadap DNA tinggi. Di sisi lain, konsentrasi pewarna cukup penting untuk menghasilkan sinyal yang baik. Dengan demikian, konsentrasi pewarna yang optimal harus digunakan untuk mencapai kinerja PCR yang baik. Mekanisme “release on demand” pada EvaGreen® membuat pewarna tersebut dapat digunakan dengan konsentrasi tinggi untuk PCR tanpa menjadi penghambat reaksi PCR, sehingga apabila kita melakukan reaksi PCR dengan EvaGreen® Dye dan SYBR® Green, maka akan terlihat nilai RFU yang lebih tinggi untuk EvaGreen® Dye, menginterpretasikan kondisi PCR dengan efisiensi reaksi yang tinggi.
Perbandingan Kurva amplifikasi antara mastermix yang mengandung EvaGreen® Dye (Hijau ) dan SYBR® Green I (Merah)
Untuk pewarna PCR seperti SYBR® Green, konsentrasi pewarna optimal dapat sangat rendah, sehingga akan membatasi sinyal PCR (dapat diamati dari nilai RFU amplifikasi yang lebih rendah) sehingga pewarna tersebut juga tidak cocok untuk analisis kurva leleh resolusi tinggi (HRM). Selain itu, campuran mastermix dengan konsentrasi SYBR® Green yang rendah juga memungkinkan kesalahan analisis pada kurva leleh (melt curve) yang tidak dapat mendeteksi beberapa amplikon karena migrasi pewarna dari amplikon kecil ke amplikon besar sehingga amplikon terlihat tunggal namun mungkin pada kenyataannya ada beberapa amplikon yang dihasilkan dari reaksi PCR.
Perbandingan RFU amplifikasi antara mastermix yang mengandung EvaGreen® Dye (Hijau ) dan SYBR® Green I (Merah)
Referensi:
https://biotium.com/technology/pcr-dna-amplification/evagreen-dye-for-qpcr/
https://www.bio-rad.com/en-sg/sku/1725201-ssofast-evagreen-supermix-500-x-20-ul-rxns-5-ml-5-x-1-ml?ID=1725201
Penulis : Sylvia Sance Marantina
Data Pendukung : Tim Application Scientist
Editor : Agung Nurfaizal
Mari Terhubung dengan Kami
Phone : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0855 1288 801
Kunjungi media sosial kami dan blog Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/