Isolasi RNA dengan 8 Kunci Sukses
Isolasi RNA merupakan tahapan yang sangat penting untuk eksperimen yang menggunakan RNA sebagai target analisis, seperti ekspresi gen, Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR), Next Generation Sequencing, analisis northern blotting, atau produksi cRNA. Kualitas serta kuantitas RNA yang diperoleh sangat mempengaruhi hasil analisis. Berbagai faktor selama pengumpulan, pemrosesan, dan penyimpanan sampel dapat berdampak negatif terhadap hasil dan harus dipertimbangkan. Faktor-faktor tersebut secara luas dapat dibagi dalam tiga kategori, yaitu:
1. Stabilitas sampel sebelum diproses
2. Pemulihan RNA selama manipulasi
3. Paparan sampel terhadap RNase
Untuk memperoleh RNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik diperlukan praktik laboratorium yang baik dalam preparasi RNA meliputi :
1. Mengetahui jenis RNA yang menjadi target analisis
RNA terdiri dari beberapa tipe yang memiliki kisaran ukuran dari 20 nt hingga 8000 nt, yaitu:
• MicroRNA (miRNA): memilki panjang 18-22 nt yang merupakan non coding RNA dan berfungsi untuk regulasi ekspresi gen pasca transkripsi
• RNA non-coding kecil (pre-miRNA, SnoRNA, atau piRNA) : memiliki panjang 20-200 nt dan terlibat dalam banyak proses seluler
• Messenger RNA (mRNA) : memiliki panjang 200 nt dan berfungsi menyalin informasi DNA ke dalam urutan asam amino yang membentuk protein
• Transfer RNA (tRNA): memiliki panjang 70-90 nt dan berfungsi membawa asam amino ke rantai peptida yang sedang tumbuh selama translasi protein
• Ribosomal RNA atau rRNA (5S, 18S, dan 28S): memiliki panjang 200 nt dan merupakan komponen ribosom
Sehingga sangat penting untuk memilih metode isolasi RNA terbaik untuk target RNA yang diinginkan karena tidak semua kit isolasi RNA dapat menangkap semua jenis RNA dengan kualitas dan kuantitas yang sama. Sebagai contoh apabila ingin melakukan isolasi RNA berukuran kecil, sebaiknya menggunakan jenis kit ekstraksi berbasis kolom dengan ukuran celah kolom yang telah disesuaikan dengan ukuran RNA target (misal. miRcute miRNA isolation kit), sehingga akan mengurangi resiko kehilangan RNA akibat kesalahan penanganan selama isolasi.
2. Mempersiapkan kondisi lingkungan kerja yang sesuai untuk isolasi RNA
Untuk mengisolasi RNA yang utuh dan berkualitas tinggi, penting agar RNase tidak masuk ke dalam sediaan RNA. RNase dapat ditemukan di mana-mana, oleh karena itu penting agar setiap alat dan bahan yang digunakan untuk isolasi RNA bebas dari RNase. Semua permukaan, termasuk pipett, meja, peralatan gelas, dan peralatan pendukung lainnya harus didekontaminasi dengan larutan dekontaminasi RNAse.
3. Memahami bagaimana cara mengkoleksi dan menyimpan sampel sebelum dilakukan ekstraksi RNA
Endogenus RNAse harus segera dinon-aktifkan saat sampel dikoleksi untuk mencegah degradasi RNA. Ada 3 cara yang dapat dilakukan:
1. Homogenkan sampel segera setelah sampel dikoleksi dengan larutan lisis sel berbasis chaotropic agent (mis., mengandung guanidinium) seperti buffer lisis yang tersedia di RNA simple Total RNA Kit atau Reagen Purezol
2. Penyimpanan dalam liquid nitrogen segera setelah sampel dikoleksi
3. Menggunakan RNAstore Reagent yaitu cairan pengawet sel atau jaringan yang tidak beracun. RNAstore dengan cepat menembus ke dalam sel / jaringan dan menghambat aktivitas RNase secara efisien sehingga mencegah degradasi RNA.
Proses koleksi dan penyimpanan sampel yang tidak tepat menjadi salah satu penyebab hasil isolasi RNA yang tidak utuh (intact). Hal tersebut akan berdampak pada hasil analisis lanjutan yang akan dilakukan, misalnya PCR. RNA yang tidak utuh akan menjadi penyebab pergeseran Cq/Ct yang dapat menyebabkan misinterpretasi hasil.
4. Memilih metode ekstraksi yang tepat
Tujuan dari pemilihan metode ekstraksi yang tepat adalah untuk mendapatkan RNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik. RNA kualitas baik berarti RNA tersebut memiliki tingkat kemurnian tinggi karena sedikit atau tidak mengandung inhibitor atau protein. Kemurnian RNA sangat mempengaruhi aplikasi biologi molekuler selanjutnya, seperti PCR. Jika tingkat kemurnian RNA rendah maka efisiensi PCR juga rendah, hal tersebut dapat dilihat dari bentuk kurva PCR yang landai.
Metode termudah dan teraman untuk isolasi RNA adalah metode berbasis kolom seperti RNA simple Total RNA Kit untuk throughput sedang hingga rendah. Untuk kebutuhan pemrosesan sampel dengan throughput tinggi, seperti sampel kultur sel, bakteri atau yeast dapat menggunakan Aurum Total RNA 96 kit untuk kemudahan penanganan. Kit Isolasi RNA Magnetic Tissue/Cell/Blood Total RNA Kit menggunakan pendekatan magnetic beads, yang dapat digunakan dengan instrument isolasi RNA otomatis untuk memproses sampel dengan throughput yang lebih tinggi.
Saat bekerja dengan jaringan atau matriks sampel yang sulit/kompleks, misalnya yang tinggi nuklease (pankreas) atau lemak (otak dan jaringan adiposa), metode isolasi RNA berbasis fenol lebih disarankan, seperti Purezol. Namun jika ingin menggunakan metode berbasis kolom dapat menggunakan Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue kit
Baca juga : Webinar dan Workshop Analisis Karbohidrat Gula
5. Menggunakan produk yang mengandung DNAse untuk mencegah kontaminasi DNA
Secara umum, sebagian besar aplikasi yang menggunakan RNA dari jaringan hewan atau sel mamalia tidak memerlukan tambahan DNase. Namun, beberapa aplikasi seperti analisis ekspresi gen oleh qRT-PCR tanpa intron spanning-primer atau sampel dari organisme dengan intron yang sangat kecil atau tanpa intron memerlukan proses penghilangan kontaminasi DNA. Kontaminasi DNA pada aplikasi ekspresi gen dapat menurunkan efisiensi reaksi PCR.
6. Mengetahui kisaran konsentrasi RNA yang akan diperoleh dari matrix sampel yang digunakan
Beberapa jaringan mengandung konsentrasi RNA tinggi dan beberapa mengandung konsentrasi RNA yang lebih rendah tergantung pada struktur jaringan dan keadaan fisiologis. Mengetahui berapa banyak jaringan yang harus diproses akan memastikan bahwa kita akan mendapatkan jumlah RNA yang cukup dengan kemurnian yang diharapkan dan sesuai untuk aplikasi dan tujuan yang ingin dicapai. Banyak Jaringan atau sampel yang dibutuhkan untuk mendapatkan RNA yang cukup dengan kemurnian yang diharapkan juga tergantung pada kit isolasi yang digunakan. Umumnya kita dapat menemukan rekomendasi jumlah sampel yang digunakan pada protokol kit isolasi RNA yang digunakan.
Baca juga : Stop Penularan TBC dengan deteksi berbasis Real-time PCR
Penulis : Sylvia Sance Marantina
Editor : Agung Nurfaizal
Mari Terhubung dengan Kami
Phone : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0855 1288 801
Kunjungi media sosial kami dan blog Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/