Purifikasi Protein Rekombinan dengan Metode His-tag atau Strep-tag ? Mana yang lebih baik ?
Protein rekombinan adalah protein yang dihasilkan melalui teknologi DNA rekombinan. Dalam proses ini, gen yang mengkode protein target diisolasi dan disisipkan ke dalam organisme host (biasanya bakteri, ragi, atau sel mamalia) untuk memproduksi protein tersebut dalam jumlah besar. Teknologi ini memungkinkan produksi protein yang tidak mudah diperoleh dari sumber alami atau dalam jumlah yang memadai. Proses produksi protein rekombinan dapat dilihat ilustrasinya pada Gambar 1.
Gambar 1. Ilustrasi proses produksi protein rekombinan
Untuk mendapatkan protein yang murni dan bekerja dengan baik sesuai dengan struktur aselinya, harus dilakukan proses purifikasi agar protein terpisah secara sempurna dari pengotor dan komponen lainnya dari sel yang digunakan seagai <i>host</i>. Metode yang paling banyak digunakan untuk memurnikan protein rekombinan adalah dengan metode kromatografi. Protein rekombinan sering kali diekspresikan dengan menambahkan tag atau label untuk mempermudah proses purifikasi. Dua metode yang umum digunakan adalah purifikasi menggunakan His-tag dan Strep-tag. Keduanya memiliki prinsip dan keuntungan tersendiri dalam pemurnian protein rekombinan.
Metode His-tag (Histidine-tag)
His-tag adalah urutan pendek asam amino yang biasanya terdiri dari 6 hingga 10 residu histidin yang ditambahkan pada ujung N-terminal atau C-terminal dari protein rekombinan. His-tag berfungsi sebagai label yang mempermudah proses purifikasi menggunakan afinitas terhadap ion logam.
Prinsip Purifikasi dengan His-tag
His-tag memanfaatkan afinitas tinggi antara residu histidin dan ion logam bivalen seperti Ni²⁺ (nikel) atau Co²⁺ (kobalt). Metode yang paling umum adalah menggunakan kolom affinitas Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriacetic acid) atau IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography). Berikut adalah langkah- langkah utama:
- Pengikatan: Protein yang mengandung His-tag akan melewati kolom kromatografi yang mengandung ion nikel atau kobalt. Histidin dalam His-tag akan berikatan kuat dengan ion logam.
- Pencucian: Protein lain yang tidak berikatan akan dicuci keluar dari kolom menggunakan buffer yang mengandung garam ringan.
- Elusi: Protein yang terikat pada kolom dilepaskan dengan menggunakan imidazol, senyawa yang bersaing dengan histidin untuk berikatan dengan ion logam.
- Penggunaan: Setelah purifikasi, protein yang mengandung His-tag dapat digunakan langsung atau His-tag dapat dipotong menggunakan protease khusus jika diperlukan.
Keuntungan His-tag:
- Purifikasi cepat dan efisien.
- His-tag relatif kecil (~1 kDa) dan tidak biasanya mempengaruhi fungsi protein.
- Dapat digunakan dalam berbagai kondisi pH dan buffer.
Kekurangan His-tag:
- Penggunaan ion logam seperti nikel dapat berpotensi menyebabkan kontaminasi protein dengan logam berat.
- Imidazol yang digunakan untuk elusi harus dihilangkan dengan proses tambahan jika sensitif terhadap protein target.
Metode Strep-tag
Strep-tag label kecil yang terdiri dari delapan asam amino (WSHPQFEK) yang memiliki afinitas tinggi terhadap streptavidin atau versi rekombinannya, Strep-Tactin. Metode ini didasarkan pada interaksi spesifik antara Strep-tag dan Strep- Tactin, suatu protein yang dimodifikasi dari streptavidin. Dengan memanfaatkan ikatan non kovalen yang sangat kuat dan spesifik di alam, protein rekombinan yang memiliki Strep- tag dapat diisolasi dan dimurnikan dalam satu langkah purifikasi dari sel lisat. Strep-tag, Twin- Strep-tag and Strep-Tactin are merupakan inovasi yang dikembangkan oleh IBA Lifesciences GmbH (Gambar 2)
Gambar 2. Produk Strep-tag dan Strep-tactin yang diproduksi oleh IBA Lifesciences
Prinsip Purifikasi dengan Strep-tag
Purifikasi menggunakan Strep-tag bekerja berdasarkan prinsip interaksi afinitas antara Strep- tag dan Strep-Tactin yang diimmobilisasi pada matriks kolom kromatografi. Berikut langkah- langkahnya (Gambar 3):
- Pengikatan: Protein yang mengandung Strep-tag akan melewati kolom yang mengandung Strep-Tactin, dan Strep-tag akan berikatan kuat dengan Strep- Tactin.
- Pencucian: Protein yang tidak berikatan akan dicuci keluar dari kolom dengan buffer pencucian yang sesuai.
- Elusi: Protein yang berikatan dengan Strep-Tactin dapat dielusi menggunakan destiobiotin atau biotin Biotin akan menggantikan Strep-tag dalam ikatan dengan Strep-Tactin, memungkinkan pelepasan protein target.
- Penggunaan: Strep-tag sering kali tidak perlu dihilangkan karena ukurannya yang sangat kecil (~1 kDa) dan tidak mempengaruhi aktivitas protein.
Gambar 3 . Tahapan purifikasi protein rekombinan dengan teknologi Strep-tag
Keuntungan Strep-tag:
- Sistem sangat spesifik dan menghasilkan protein dengan kemurnian tinggi.
- Strep-tag sangat kecil sehingga jarang mempengaruhi struktur atau fungsi protein.
- Elusi dilakukan dengan lembut menggunakan biotin, yang sering kali lebih bersahabat terhadap protein dibandingkan dengan imidazol.
- Tidak perlu elusi dengan gradient, cukup menggunakan 1 buffer saja
Kekurangan Strep-tag:
- Interaksi antara Strep-tag dan Strep-Tactin dapat terganggu oleh beberapa buffer yang mengandung deterjen atau garam konsentrasi tinggi.
- Daya afinitas yang lebih lemah dibandingkan His-tag, sehingga mungkin memerlukan langkah tambahan untuk meningkatkan hasil.
Perbandingan Antara His-tag dan Strep-tag
.webp)
Kesimpulan
Pemilihan antara His-tag dan Strep-tag bergantung pada kebutuhan spesifik dari eksperimen. His-tag memberikan fleksibilitas dan efisiensi dalam berbagai kondisi purifikasi, sementara Strep-tag menawarkan kemurnian yang lebih tinggi, proses purifikasi yang cepat (1 lngkah), dan tidak perlu proses penghilangan larutan elusi dan tag pada tahap akhir pemurnian.
Penulis: Kurdianto, M.Si
Editor: Agung Nurfaizal
Mari Terhubung dengan Kami
Telepon Kantor : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0858 8880 0005
Kunjungi media sosial Offical Sciencewerke
Instagram : @sciencewerke_id
Linkedin : PT Sciencewerke
X : Sciencewerke ID
Youtube: PT Sciencewerke