Aplikasi Teknologi KASP Genotyping dalam Identifikasi SNPs
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) merupakan variasi genetik yang paling sering ditemukan pada sekuens DNA. Pada SNP terjadi perubahan nukelotida di posisi tertentu dalam gen, misalnya adalah perubahan nukleotida cytosine (C) menjadi adenine (A). Perubahan nukleotida tersebut normal terjadi pada genom manusia, dimana perubahan ini umumnya terjadi pada 1 dari 1000 nukelotida. Variasi nukleotida ini dapat dikategorikan sebagai SNP apabila ditemukan pada >1% populasi.
Secara umum, SNP terletak pada daerah yang berada di antara gen. Namun, SNP juga dapat ditemukan di dalam gen. Variasi genetik ini dapat berperan sebagai marka molekuler yang digunakan para peneliti untuk mengetahui hubungan antara gen tertentu dengan suatu penyakit. Jika SNP berada pada suatu gen atau terletak di regulatory region gen tertentu, maka terdapat kemungkinan bahwa SNP tersebut dapat memengaruhi fungsi gen secara langsung.
Baca juga : Mudah, Sederhana, dan Cepat dengan Proteus Protein A Purification Kit
SNP berbeda dengan substitusi DNA, dimana dalam substitusi DNA perubahan nukleotida dapat menghasilkan asam amino berbeda. Dalam kasus substitusi DNA, perubahan ini dapat menimbulkan penyakit dan juga ditemukan pada <1% populasi. Sebagian besar SNP tidak berpengaruh terhadap kesehatan atau perkembangan manusia. Penelitian tentang SNP dapat membantu dalam penelitian kesehatan seperti: memprediksi respon individu terhadap obat-obatan, respon terhadap faktor lingkungan, dan resiko untuk memiliki penyakit tertentu. Selain itu, SNP dapat pula digunakan sebagai genetic fingerprint yang dapat dimanfaatkan untuk identifikasi genetik.
Sejalan dengan pesatnya penelitian mengenai SNP, maka banyak teknologi biologi molekuler yang sudah dikembangkan untuk dapat mendeteksi SNP (SNP genotyping). Salah satu metode yang banyak diterapkan dalam SNP genotyping adalah metode Kompetitive Allele-specific PCR (KASP). KASP dikembangkan berdasarkan teknik allele specific PCR dan fluorescence resonance energy transfer (FRET) untuk menghasilkan sinyal fluorescence. Sinyal fluorescence ini akan dikonversi dalam bentuk cluster plot sehingga genotype dari SNP target dapat dianalisis.
Metode KASP ini cukup sederhana, fleksibel, mudah untuk dikerjakan, dan memiliki tingkat akurasi yang tinggi. Terdapat 3 komponen utama dalam KASP, yaitu DNA yang sudah dipurifikasi, KASP Assay mix dan KASP Master mix. Dalam KASP Assay mix terdapat 2 primer forward yang spesifik terhadap masing-masing alel, dan 1 primer reverse yang bersifat umum (dapat mengenali kedua alel). Kemudian dalam KASP Master mix terdapat universal fluorescent probes, Taq polymerase dan dNTP dalam larutan buffer PCR yang telah dioptimasi.
Gambar 1. Komponen dan prinsip kerja KASP (LGC Biosearch Technologies)
Pada tahap awal PCR KASP, terjadi proses denaturasi template DNA untai ganda. Kemudian dilanjutkan dengan proses annealing primer, dimana primer-primer spesifik akan berkompetisi untuk menempel pada template DNA. Setelah proses annealing selesai, terjadi proses amplifikasi DNA target. Primer forward yang spesifik alel memiliki sekuens unik di bagian 5’ yang dapat dikenali oleh sekuens universal probes. Siklus PCR berlanjut dan jumlah dari DNA komplemen yang mengandung sekuens unik semakin meningkat. Pada tahap berikutnya universal probes yang dilabeli masing-masing oleh fluorophore FAM dan HEX akan berkomplemen dengan sekuens unik pada DNA target, sehingga dihasilkan sinyal fluorescence. Pada akhir proses PCR, sinyal-sinyal fluorescence ini akan dikonversi dalam suatu cluster plot. Data cluster plot kemudian dapat dianalisis dan setiap poin data yang ditampilkan mewakili genotype dari setiap sampel (Gambar 2).
Gambar 2. Hasil analisis genotyping KASP assay dalam bentuk cluster plot menggunakan allelic discrimination software (CFX Maestro, Bio-Rad). Sampel homosigot FAM ditandai dengan poin data berwarna oranye dan sampel homosigot HEX ditandai dengan poin data berwarna biru. Sedangkan poin data berwarna hijau mewakili sampel heterosigot dan poin data berwarna hitam adalah No Template Controls (NTCs)
Baca juga : Oktober Sehat, PCR Hemat dengan Seegene, Diskon hingga 30% untuk Produk Seegene
Metode KASP banyak digunakan dalam aplikasi SNP genotyping terkait penyakit, sebagai contoh pemanfaatan KASP dalam SNP genotyping terkait penyakit adalah analisis SNP rs9939609 pada gen FTO terkait obesitas. Pada SNP ini terjadi perubahan nukleotida T menjadi A. Perubahan basa ini menunjukkan bahwa individu yang membawa alel A memiliki resiko obesitas lebih tinggi dibandingkan dengan individu dengan alel T berdasarkan data-data penelitian yang dilakukan pada beberapa populasi, seperti Caucasian, Japanese and Chinese. Selain itu, pemanfaatan KASP dapat diterapkan pula untuk aplikasi marker-assisted selection (MAS), quantitative trait locus (QTL) mapping, dan quality control (QC) genotyping pada bidang agrikultur dan akuakultur.
Penulis: Maria Swastika, M.Biomed
Refernsi :
- Shastry, B.S. SNPs in disease gene mapping, medicinal drug development and evolution. J Hum Genet 52, 871–880 (2007). https://doi.org/10.1007/s10038-007-0200-z
- What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)?. Diakses melalui: https://medlineplus.gov/genetics/understanding/genomicresearch/snp/
- How does KASP work?. Diakses melalui: https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp- work
- Fang H, Li Y, Du S, Hu X, Zhang Q, Liu A, Ma G. Variant rs9939609 in the FTO gene is associated with body mass index among Chinese children. BMC Med Genet. 2010 Sep 22;11:136. doi: 10.1186/1471-2350-11-136.
- Dwiningsih, Y., Rahmaningsih, M., & Alkahtani, J. (2020). Development of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Markers in Tropical Crops. Advance Sustainable Science, Engineering and Technology, 2(2), 0200202. doi: https://doi.org/10.26877/asset.v2i2.6279
Mari Terhubung dengan Kami
Telepon Kantor : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0858 8880 0005
Kunjungi media sosial Offical Sciencewerke
Instagram : @sciencewerke_id
Linkedin : PT Sciencewerke
X : Sciencewerke ID
Youtube: PT Sciencewerke