Standar Analisis Karbohidrat Secara HPLC Menggunakan Mode Ion Moderated
Karbohidrat merupakan makromolekul berbentuk polimer yang dapat dipecah dan diturunkan ke molekul sederhana yang berbobot lebih rendah seperti oligosakarida hingga gula monomernya seperti glukosa. Karbohidrat adalah metabolit primer yang berfungsi sebagai sumber energi. Metabolit primer adalah produk metabolisme utama yang dihasilkan secara biologis dan berfungsi menunjang pertumbuhan serta perkembangan tubuh makhluk hidup. Metabolit ini berdampak besar dalam pembentukan struktur fisik dan senyawa lain serta mempertahankan fungsi fisiologis tubuh.
Selain sebagai sumber energi, manfaat karbohidrat juga dapat membantu pertumbuhan bakteri menguntungkan, menurunkan kolesterol, meningkatkan penyerapan kalsium, antimikroba, dan lain-lain. Sebagai produk turunan karbohidrat yang berantai pendek, oligosakarida juga memiliki aktivitas biologis lain seperti prebiotik sehingga merangsang pertumbuhan bakteri yang menguntungkan di dalam usus sehingga membantu ketahanan sistem pencernaan. Oligosakarida juga membantu melindungi tubuh dari infeksi dengan menjaga membran. Oligosakarida yang dikandung dalam ASI, yaitu human milk oligosaccharides (HMO), membantu menurunkan risiko alergi pada bayi. Selain itu, oligosakarida juga membantu meningkatkan penyerapan kalsium, mengurangi risiko kanker usus besar, menurunkan kadar kolesterol, meningkatkan imunomodulator dan anti sifat infeksi. Dalam dunia industri, karbohidrat digunakan sebagai produk bernilai tambah seperti prekursor oligosakarida dan turunannya, bahan dalam industri makanan, adiktif pakan, dan lainnya.
Baca Juga: Seminar & Workshop Lateral Flow Assay : From Basic To Product Prototype, Bersama dengan PT. Indomabs
Analisis karbohidrat dapat dilakukan dengan metode kromatografi. Namun tidak optimal menggunakan 2 mode umum, yaitu fasa normal (normal phase) dan fasa terbalik (reverse phase), karena karbohidrat banyak mengandung gugus fungsi polar sehingga berinteraksi tidak seimbang antara fasa diam dan fasa gerak. Hal ini berpengaruh terhadap rentang deteksi yang dapat diterima dan keterpisahan antar analit. Pada sistem reverse phase, karbohidrat terlalu lemah berinteraksi dengan fasa diam yang bersifat non-polar sehingga tidak cukup tertahan dan mudah terbawa fasa gerak yang sifatnya polar. Kebalikkannya, pada sistem fasa normal karbohidrat tertahan kuat di fasa diam yang bersifat polar, namun tidak mudah terbawa oleh fasa gerak non polar. Hal ini dapat diatasi dengan memodifikasi fase gerak, pada fasa normal tersebut dapat diatasi dengan memberikan fase gerak organik polar seperti asetonitril, sehingga karbohidrat yang bersifat sangat polar sedapat terelusi dan terjadi pemisahan. Teknik ini disebut hydrophilic liquid chromatography atau yang disingkat HILIC.
Gambar Mode Pemisahan pada Kromatografi
Selain mode kerja tersebut, ada juga sistem ion moderated yang berlaku pada kolom HPLC dari Biorad, yaitu Aminex. Ion moderated adalah mode ganda, gabungan dari berbagai mode, dengan mode utama ligand exchange dan size exclusion. Mirip dengan HILIC, sistem ligand exchange Aminex mempunyai ion positif (kation) sebagai ligand pada fasa diam sehingga dapat menahan molekul karbohidrat melalui interaksi kovalen koordinat dan sekaligus fase gerak yang bersifat polar. Hal ini berarti eluen yang digunakan lebih sederhana dan efisien. Pada sistem Aminex, tidak diperlukan modifikasi rumit pada eluen namun telah diantisipasi dengan modifikasi awal terhadap kolom oleh pabrik untuk memberikan kemudahan dan kenyamanan bagi pemakai dalam segi kemudahan, kepraktisan, dan efisiensi. Aminex mengandung ion yang dapat dipertukarkan, disebut counter ion, berupa kation yang terikat pada gugus fungsi sulfonat, seperti resin penukar kation. Karbohidrat memiliki banyak gugus fungsi hidroksil (OH) yang akan berinteraksi dengan counter ion tersebut membentuk ikatan kovalen koordinat. Hal ini terjadi karena adanya pasangan elektron bebas pada atom O dari hidroksil yang dapat didonorkan secara penuh ke atom pusat, ion yang cenderung berupa unsur logam, contohnya interaksi yang ditunjukkan oleh hidroksil dengan counter ion berupa ion kalsium (Ca) dan ion perak (Ag) pada Gambar interaksi ligand exchange.
Baca Juga: PT Sciencewerke Berpartisipasi dalam Acara ACQALM yang bertema Quality Assurance
Gambar Interaksi Ligand Exchange
Sekilas mekanisme dan struktur pada fasa diam Aminex tampak sebagai ion exchange pada resin penukar kation (ion positif). Namun, interaksi sebenarnya adalah ligand exchange yang merupakan interaksi langsung terhadap analitnya, yaitu karbohidrat, dengan kation pada resin tersebut. Fasa diam yang digunakan mengikuti standar pharmacopeia, yaitu menggunakan pengisi kolom dengan rantai punggung polimer berupa divinilbenzen stirena (kopolimer). Kopolimer tersebut disulfonasi sehingga mempunyai bagian struktur sisi aktif yang dapat bermuatan negatif sehingga dapat mengikat kation, sehingga bisa berfungsi sebagai penukar kation. Namun, sejatinya interaksi dengan karbohidrat adalah ligand exchange. Counter ion yang terikat pada sulfonat berfungsi sebagai atom pusat yang menerima atom donor dari hidroksil dalam mekanisme ligand exchange. Hidroksil dari karbohidrat menggantikan hidroksil dari air. Interaksi ini memoderasi pergerakkan karbohidrat berdasarkan strukturnya sehingga terjadi pemisahan.
Pemilihan counter ion mempengaruhi analisis, baik terhadap analit target dan kondisi kerja terutama pH. Counter ion berpengaruh terhadap keterpisahan analit dan resolusi kromatogram. Terlihat pada “Gambar Kromatogram Aminex 87H dan 87C”, glukosa dapat terpisah pada kolom Aminex 87C menjadi 2 peak terpisah pada kromatogram B, berbeda dengan kromatogram A yang hanya ada satu peak yang menginterpretasikan glukosa. Pada kromatogram A, kedua peak adalah sama-sama glukosa namun berbeda orientasi 3D-nya pada karbon asetal/hemiasetal dalam struktur sikliknya, dinamakan anomer. Kemampuan tersebut hanya disebabkan oleh perbedaan counter ion, yaitu ion Calcium (C) pada Aminex 87C dan ion Hydrogen (H) pada 87H. Ion dari unsur logam Calcium (C) pada Aminex 87C dapat memberikan interaksi spesifik secara struktural dalam orientasi ruang sehingga memungkinkan terjadi pemisahan anomer. Kemampuan pemisahan karena efek counter ion, juga berpengaruh pada resolusi peak seperti yang ditunjukkan pada pada “Gambar Kromatogram Aminex 87C dan 87P”. Tampak bahwa resolusinya pada 87P dengan counter ion timbal/Plumbum (P) tampak lebih baik dengan munculnya beberapa peak terpisah lebih banyak dibandingkan 87C yang mempunyai counter ion Calcium (C).
Gambar Kromatogram Aminex 87H dan 87C
Gambar Kromatogram Aminex 87C dan 87P
Ada berbagai tipe kolom Aminex disesuaikan dengan kebutuhan aplikasinya beberapa di antaranya dapat dideskripsikan pada “Gambar Berbagai Tipe Kolom Aminex Sesuai Aplikasinya”. Aminex HPX-87C diaplikasikan untuk analisis gula secara umum bisa untuk mono, di, tri, tetrasakarida. Aplikasi Aminex HPX-87H untuk analisis monosakarida bersama dengan asam organik dan alkohol dalam fermentasi. Aminex HPX-87P digunakan terutama dalam analisis monosakarida yang diturunkan dari selulosa seperti dari hidrolisat tanaman atau kayu. Aminex HPX-87N diperuntukkan untuk analisis karbohidrat dalam sampel yang mengandung garam tinggi dan Aminex HPX-87K jika garam kaliumnya tinggi seperti di sirup jagung. Aminex HPX-42A untuk analisis karbohidrat oligosakarida hingga DP 11. Aminex kompatibel dengan berbagai instrument HPLC, seperti Shimadzu, Agilent, dan Waters, bahkan bisa digunakan di NGC sebuah platform kromatografi preparatif dengan tekanan medium.
Gambar Berbagai Tipe Kolom Aminex Sesuai Aplikasinya
Referensi:
1) Artikel https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128214473000019
2) Guidelines for Use and Care of Aminex® Resin-Based Columns
3) Farmakope Indonesia Edisi ke-6
Baca Juga: Promo Bio-Rad iTaq™ Universal Probes Supermix, Buy 2 Get 1 Free
Penulis : Sujono, M.si
Editor : Agung Nurfaizal
Mari Terhubung dengan Kami
Phone : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0858 8880 0005
Kunjungi media sosial Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/