Teknologi Stain-Free Western Blot : Hasil Lebih Cepat dan Data Lebih Baik
Teknologi Stain-Free Western Blot merupakan metode analisis protein yang sangat popular bagi peneliti biologi melekuler. Namun, analisis wertern blot dengan cara tradisional memerlukan langkah yang banyak dan waktu yang lama, yang dapat menghasilkan hasilnya bervariasi. Secara umum langkah kerjanya memerlukan waktu sekitar 2 hari hingga mendapatkan hasilnya. Teknologi stain-free western blot muncul untuk memberikan kemudahan proses analisis dan langkah yang sedikit, sehingga data yang dihasilkan lebih baik dan lebih cepat.
Bagaimana caranya ?
Teknologi stain-free western blotting, memperbaiki workflow tradisional dengan cara mengurangi waktu pengerjaan dan memungkinkan peneliti untuk melakukan check point pada setiap langkahnya untuk mengidentifikasi kemungkinan adanya masalah pada tahapan elektroforesis, transfer, dan blotting (inkubasi antibodi). Dengan menggunakan teknologi ini pula, peneliti bisa mendapatkan data kuantitatif dengan analisis normalisasi total protein. Analisis ini, tidak membutuhkan lagi housekeeping protein (GAPDH, Aktin, dll) sebagai standard untuk proses normalisasi.
Lalu, apa itu teknologi stain-free western blot ?
Teknologi stain-free western blot menggunakan seyawa “trihalocompound” yang dimasukkan ke dalam komposisi gel akrilamida. Setelah disinari dengan UV pada proses aktivasi, senyawa ini akan memendarkan sinya fluorescence alami dengan mengikat residu triptofan secara kovalen, sehingga sinyal tersebut akan dibaca oleh imaging system dan dirubah menjadi sinyal digital.
Gambar 1. Ilustrasi teknologi stain-free western blot (BioRad)
Teknologi ini dapat menghilangkan proses staining dan destaining dengan coomassie blue yang biasanya memerlukan waktu hingga semalaman. Sensitifitas dari teknolog ini bahkan lebih tinggi dari pewarna coomassie blue, yaitu 10-25 ng.
Baca juga : Isolasi RNA dengan 8 Kunci Sukses
Berikut 3 alasan utama mengapa kita harus beralih ke teknologi stain-free :
1. Hasil SDS-PAGE dapat diamati hanya dalam hitungan menit setelah elektroforesis
Jika menggunakan pewarna coomassie blue setidaknya kita memerlukan waktu 1-2 jam untuk proses staining, dan sampai semalaman untuk proses destaining hingga hasilnya SDS-PAGE bisa kita amati, dan kekurangannya adalah gel yang sudah diwarnai tidak bisa dilanjutkan ke analisis western blot, sehingga jika menggunakan cara konvensional harus running 2 gel. Dengan menggunakan teknologi stain-free, gel dapat langsung diambil dan difoto menggunakan imager tanpa melalui proses pewarnaan, karena molekul stain-free nya sudah ada di dalam gel akrimalida. Proses imaging sangat cepat dan sederhana, cukup aktivasi gel dibawah sinar UV pada Biorad imager selama 1-5 menit, lalu foto gel dengan imager.
Gambar 2. Hasil foto gel SDS-PAGE, (a) menggunakaan pewarnaan coomassie blue dengan destaining semalaman dan (b) 4-20% TGX Stain-Free gel dengan aktivasi selama 1 menit
Sensitifitas dari teknologi stain-free sama atau bahkan lebih baik dibandingkan dnegan pewarnaan Coommassie Blue, terutama untuk volume sample loading yang tinggi, dan tidak membutuhkan tambahan reagent untuk proses pewaranaanya. Gel hasil pewaraan stain-free juga dapat langsung dilanjutkan ke proses transfer membrane untuk analisis western blot, sehingga hanya memerlukan 1 gel saja, lebih hemat dan lebih cepat.
> Klik Di sini Untuk Produk Stain-Free Gel Biorad
2. Memungkinkan check point pada setiap tahapan untuk quality control
Pada analisis western blot secara konvensional, kita harus menggunakan 2 gel untuk proses QC untuk setiap langkahnya, itu pun belum tentu sama persis dengan sample yang dilanjutkan ke inkubasi antibodi, sehingga agak sulit untuk melakukan QC pada tahapan elektroforesis, transfer, dan juga blotting dengan antibodi. Yang sering terjadi adalah, setelah inkubasi antibodi, tidak ditemukan band protein target, dan peneliti sulit menganalisa pada langkah mana terjadi kesalahan. Dengan menggunakan teknologi stain-free, kita dapat melalukan check point setelah proses elektroforesis dan setelah transfer (analysis pre dan post transfer) (Gambar 3). Kemampuan ini akan mengurangi potensi terbuangnya waktu untuk proses QC (staining dan destaining) dan terbuangnya reagent akibat kesalahan pada setiap langkahnya.
Gambar 3. Hasil capture foto gel setelah SDS-PAGE, membrane setelah transfer, dan gel setelah proses transfer ke membrane nitrocellulose/PVDF
Setelah proses elektroforesis, aktivasi dan foto gel stain-free untuk melihat migrasi dari sample protein. Lalu, transfer protein dalam gel ke mebrane nitrocellulose/PVDF dengan menggunakan transfer system, seperti Trans-Blot Turbo, Trans-Blot SD, dan Trans-Blot Cell. Setelah selesai, foto membrane yang sudah berisi protein dengan menggunakan imager, membrane tidak perlu lagi diwarnai dengan Ponceau, karena sudah mengandung teknologi stain-free dari gel. Foto juga gel setelah proses transfer untuk melihat transfer efisiensi, pastikan semua protein yang berada di gel berpindah semua ke membrane.
Peneliti dapat melakukan tiga langkah tersebut tanpa memerlukan proses staining dan destaining yang memerlukan waktu lama. Setelah semua langkah dilakukan, membrane dapat digunakan untuk proses selanjutnya, yaitu blocking, washing, dan inkubasi antibodi primer dan sekunder hingga deteksi antibodi dengan pewarna substrat.
> Klik Di Sini Untuk Instrument Workflow Stain-Free Western Blot Biorad
3. Analisis yang akurat dan sederhana dengan Total Protein Normalization
Benefit yang paling diunggulkan dari teknologi stain-free adalah bisa melakukan analisis normalisasi total protein tanpa harus melakukan proses pewaranaan dan langkah lanjutan. Analisis ini sangat membantu peneliti untuk menghitung nilai ekspresi dari suatu protein target tanpa harus melakukan re-probing dengan housekeeping protein seperti GAPDH ataupun Actin sebagai kontrol normalisasinya. Karena sinyal hasil foto dengan teknologi stain-free tidak dipengaruhi oleh amplifikasi sinyal, seperti yang dilakukan dengan metode konvensional menggunakan housekeeping protein, terkadang terjadi saturasi sinyal jika loading protein terlalu banyak.
Ekspresi dari housekeeping protein juga kadang tidak sesuai dengan total protein yang dimasukkan ke dalam gel, walaupaun sudah dilakukan pengenceran berseri, ekspresinya tetap sama, sehingga kurva standard yang terbentuk tidak linier dan akan sangat mempengaruhi hasil kalkulasi ekspresi protein tergetnya (Gambar 4). Analisis dengan normalisasi total protein juga lebih baik dibandingkan dengan metode analisa dengan housekeeping protein, dimana nilai ekspresinya tidak dipengarui oleh perlakuan eksperimen dan memberikan hasil yg lebih akurat (Hu et al. 2016).
Gambar 4. Analsis normalisasi total protein dengan teknologi stain-free. (A) sinyal total protein stain-free, (B) sinyal β-actin, (C) sinyal β-tubulin, (D) sinyal GAPDH, (E) perbandingan kurva linieritas analisis normalisasi total protein dan housekeeping protein dengan pengenceran berseri.
References :
Hu X et al. (2016). Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better “housekeeper.” Oncotarget 7: 66,679–66,688.
Baca juga : Stop Penularan TBC dengan deteksi berbasis Real-time PCR
Penulis : Kurdianto M.Si
Editor : Agung Nurfaizal
Mari Terhubung dengan Kami
Phone : 021 5366 7591
Email : [email protected]
WhatsApp : 0855 1288 801
Kunjungi media sosial kami dan blog Offical Sciencewerke:
Instagram: https://www.instagram.com/sciencewerke_id/
Linkedin: https://www.linkedin.com/company/pt-sciencewerke/